Mutacja FOXL2 w guzowatych komórkach jajnika cd

Domniemane mutacje punktowe oraz małe insercje i delecje zostały zidentyfikowane (szczegółowe informacje znajdują się w sekcji Metody w dodatkowym dodatku). Mutacje te zostały porównane z bazami danych genomu ludzkiego w celu wyeliminowania wcześniej opisanych wariantów linii zarodkowej. Niestabilność genomu próbek wskaźnikowych określono przy użyciu macierzy genotypowania Affymetrix 6.0 zinterpretowanych dla liczby kopii. Mutacja Walidacja
Wyselekcjonowaliśmy warianty obecne w co najmniej trzech z czterech bibliotek sekwencjonowania RNA GCT i przebadaliśmy biblioteki sekwencjonowania RNA od 10 guzów jajnika nie-GCT i od linii komórek pochodzących z surowic granicznych od guza na obecność wariantów pochodzących z GCT. Wersje transkryptomu, które były nieobecne w 11 guzach jajnika nie-GCT, zostały sklasyfikowane jako warianty specyficzne dla GCT i poddane dalszej analizie. Potwierdziliśmy identyfikację wariantów specyficznych dla GCT przy użyciu sekwencjonowania Sangera amplikonów PCR cDNA i genomowego DNA (gDNA) uzyskanych z próbek indeksu (zarówno guza, jak i dopasowanej normalnej tkanki, gdy jest dostępna).
Zastosowaliśmy kombinację bezpośredniego sekwencjonowania, analizy polimorfizmów o długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) oraz opartego na PCR PCR w czasie rzeczywistym TaqMan w czasie rzeczywistym (Applied Biosystems) do genotypowania mutacji FOXL2 402C . G w dodatkowych rakach (patrz Słowniczek ). W pierwotnych badaniach walidacyjnych próbki były oceniane jako pozytywne lub negatywne dla tej mutacji tylko wtedy, gdy były wyraźne i zgodne wyniki z co najmniej dwóch testów. Zastosowanie testów z różnymi starterami miało na celu zminimalizowanie artefaktów PCR spowodowanych przez wzmocnienie słabej jakości matryc DNA z utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie bloków tkankowych.18 Testy TaqMan i RFLP dały jasne i zgodne wyniki dla wszystkich 149 guzów innych niż GCT. , jak również dla próbek GCT o indeksie 4, a wyniki te były zgodne z wynikami z sekwencjonowania 74 próbek z możliwymi do interpretacji wynikami ze wszystkich testów. W przypadkach, w których analiza PCR-RFLP nie wytworzyła produktu PCR o wystarczającej jakości i ilości do dalszej analizy (prawdopodobnie z powodu niskiej jakości matrycowego DNA), zastąpiono ją testem TaqMan, który był również stosowany w pierwotnym badaniu przesiewowym pod kątem dodatkowa seria SCST badanych w celu określenia częstotliwości mutacji w powiązanych nowotworach.
Wyniki
Transkrypcja całego transkryptomu RNA w parze-końcu
Tabela 1. Tabela 1. Podsumowanie generowania danych z sekwencjonowania sparowanego końca całego transkryptomu RNA. Stabilność genomowa czterech wskaźników GCT została potwierdzona przez wnioskowanie zmian liczby kopii DNA z matryc genotypowania o dużej gęstości (ryc. w dodatkowym dodatku). Próbki następnie poddano sekwencjonowaniu RNA. Całkowita liczba odwzorowanych sekwencji DNA i całkowita liczba odczytów (które obejmowały frakcję sekwencji egzonów, intronów i intergenów), liczbę objętych par zasad i szczegóły dotyczące wariantów wykrytych w próbkach 4 GCT oraz w inne 11 bibliotek porównawczych pochodzących z nowotworów jajnika przedstawiono w tabeli 1. Odczyty sekwencji z tych próbek wykazały spodziewaną ekspresję genów różnicowych specyficznych dla podtypu (ryc. 2 w dodatkowym dodatku).
Walidacja wariancji implikowanych
Rysunek 2
[podobne: obróbka strumieniowo ścierna, srebro lokacyjne, odżywka do rzęs ]

Powiązane tematy z artykułem: obróbka strumieniowo ścierna odżywka do rzęs srebro lokacyjne